Исследование механизмов цитотоксического действия растительных лектиноввискумина и рицина

Рицин – токсин, выделенный из семян клещевины обыкновенной (Ricinus communis), который принадлежит к семейству RIP-II – белков, инактивирующих рибосомы. Из-за его высокой токсичности, доступности и стабильности, он классифицируется как агент высокой биологической угрозы. С другой стороны, вискумин  – лектин, выделенный из омелы белой (Viscum album), также принадлежит семейству RIP-II, однако обладает значительно меньшей токсичностью и давно используется в медицинских целях. В настоящее время показана его иммуномодулирующая, противовоспалительная и антиопухолевая активность, однако данные о механизмах почти полностью отсутствуют. Выяснение этих механизмов необходимо для дальнейшего прогресса в создании лекарственных средств на его основе и потому чрезвычайно актуально. Сходство с намного более хорошо изученным рицином облегчает поиск клеточных путей, на которые воздействует вискумин, и позволяет полагать, что сравнительное изучение цитотоксичности этих лектинов - наиболее простой путь к выявлению механизмов действия вискумина. 

Имеющиеся на сегодняшний день данные позволяют сделать вывод о том, что дифференциальная токсичность рицина и вискумина может быть определена большим набором факторов, в том числе различиями во внутриклеточном транспорте этих двух токсинов. Белки семейства RIP-II состоят из двух цепей, А и В. А-цепь обладает каталитической активностью и гидролизует N-гликозидную связь аденозина в положении А4324 𝛼-сарцин-рициновой петли (28S рРНК 60S субъединицы эукариотических рибосом, что приводит к блокировке связывания фактора элонгации EF-2 с рибосомой, вследствие чего останавливается синтез белка в клетке. В-цепь – лектин, который обеспечивает связывание со специфическим углеводным фрагментом на клеточной поверхности, что облегчает проникновение токсина внутрь клетки. B-цепь рицина связывает концевой N-ацетилгалактозамин и остатки β-1,4-связанной галактозы, тогда как B-цепь вискумина помимо галактозы также узнает и связывает концевой остаток сиаловой кислоты. Галактозильные остатки присутствуют на поверхности большинства типов эукариотических клеток, поэтому практически все типы клеток являются чувствительными к этим лектинам. 

В данном исследовании мы проанализируем цитотоксичность двух токсинов на двух клеточных линиях: контрольной клеточной линии рака молочной железы MDA-MB-231shLUC и клеточной линии с нокдауном гена IGFBP6 (MDA-MB-231shIGFBP6). Нокдаун гена IGFBP6 приводит к значительным изменениям в липидном метаболизме, что позволит проанализировать вклад везикулярного транспорта, а именно белков семейства Rab, координирующих события транспорта везикул внутри клетки, в дифференциальную цитотоксичность. Анализ литературных данных показывает, что вклад данных белков в цитотоксичность двух токсинов (рицина и вискумина) еще не был исследован.

Помимо этого, мы проанализируем активность А-цепей обоих токсинов с помощью RT-PCR в реальном времени, используя праймеры, подобранные на участок модификации рРНК. Существующие на данный момент методики подсчета количества модифицированных рРНК являются либо полуколичественными, либо используют пары праймеров, имеющие различное количество мисматчей к модифицированным и интактным молекулам рРНК. По предварительной оценке, такой подсчет оказывается смещенным и не дает возможности реально оценить долю модифицированных рРНК в клетках. Разрабатываемая нами методика будет основываться на синтезе искусственных матриц, аналогичных модифицированной токсинами и интактной рРНК, что даст возможность проверить правильность подсчета доли инактивированных токсинами рибосом. 

Далее мы проанализируем эндоцитоз и экзоцитоз токсинов методом проточной цитометрии, используя трипановый синий для гашения флуоресценции с поверхности клеток. Это позволит рассчитать количество токсинов, связывающихся с поверхностью клеток и эндоцитированных внутрь клетки. Данная методика позволяет получить количественные результаты с высокой степенью точности и, насколько нам известно, не применялась ранее для этих целей .

По окончанию исследования будут проанализированы: количество сайтов связывания рицина и вискумина на поверхности клеток, скорость эндоцитоза, характеристики экзоцитоза, доля модифицированных рибосом, вклад белков Rab в везикулярный транспорт токсинов. Каждый из этих этапов может вносить вклад в токсичнсть рицина и вискумина, что позволит выявить различия в их механизмах цитотоксического действия. Это послужит шагом на пути к созданию иммуномодулирующих и антиопухолевых препаратов на основе вискумина.